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problemas con el gram
lauraemilce80
Invitado

 
#1
Mensaje enviado el: 02-10-2009, 01:21 AM

hola a todos, les cuento que estuve haciendo unas tinciones para tratar de identificar unas colonias que aparecieron en placas de vino fraccionado.
El resultado es que las colonias son de bacterias, bacilos cortos y gruesos, dispuestos en pares o en cadenas....el problema es que no puedo identificar bien el resultado del gram de estas bacterias, a promera vista me parece que son gram negativas, lo que me lleva a pensar en bactarias aceticas, pero si muevo un poco el enfoque del microscopio las veo mas oscuras, pareciendo mas gram positivas y realmente no puedo diferenciar bien que tipo de bacterias tengo...cualquier ayuda sobre eso me venfria bien

saludos
vamonosdevinos
Super Forero
Sin conexión

#2
Mensaje enviado el: 08-10-2009, 12:16 AM

Hola lauraemilce80, la verdad es que una cosa es identificar cocos acéticos al microscopio ( no hay discusión si son cocos es que son acéticos) y otra más dificil es determinar bacilos como acéticos o como lácticos. Si te parece repasemos la tinción de gram:

Técnica:
- Fijar las bacterias con calor
- Aplicar un colorante básico que suele ser cristal violeta ( 2 min )
- Lavar con agua al grifo
- Aplicar un mordiente (fijador) que es el Lugol ( 30 seg.)
- Lavar con alcohol de 95º ( 15 min. y removiendo)
- Lavar al grifo
- Aplicar colorante ácido ( Safranina ) ( 10 seg.)
- Lavar con agua y dejar secar al aire.
- Sellar con cubre y observar con objetivo x100 de inmersión (en aceite de cedro )

Identificación:

Gram(+) veremos los bacilos violeta o azul oscuro como consecuencia de la impermeabilidad de su pared celular al alcohol y las identificaremos como BACTERIAS LACTICAS

Gram(-) los veremos de color rosa por la permeabilidad de su membrana celular al alcohol y por efecto de la Safranina, las identificaremos como BACTERIAS ACETICAS.

Si estas empleando la técnica de Gram Standard (con yodo ) pues te recomiendo el protocolo anterior.

Si aún así te resulta difícil la identificación te aconsejo la prueba de la catalasa que consiste en añadir H2O2 de 10 vol.(3% en peso) a partir de 1 ml de perhidrol por 9 ml de agua dest. directamente sobre la colonia de cultivo. Una gota bastará para poner en evidencia la existencia de catalasa advirtiendonos de la presencia de la enzima mediante la aparición de un incipiente barboteo de burbujitas de oxígeno.

Si la prueba da positiva (+) a la catalasa tienes una colonia de bacterias acéticas y si da negativa(-) se trata de bacterias lácticas.

Espero haberte sido de ayuda, si necesitas contrastar modo de preparación de los reactivos dímelo.

Por cierto, la retroiluminación de algunos microscopios a veces puede confundir el resultado gram.

Recibe un saludo y cuentanos el desenlace.


[Imagen: vamonosdevinos2.jpg]
EL VINO ES UN EQUILIBRIO
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Lauraemilce
Enófilo
Sin conexión

#3
Mensaje enviado el: 12-10-2009, 11:23 PM

Muchas gracias por tu ayuda, te cuento que el procedimiento de tinción que yo uso es muy parecido al que me pasas, solo difieren un poco los tiempos, pero como es un kit de colorantes comerciales me baso directamente en las instrucciones del mismo.
En primer lugar, me queda una duda de tu respuesta, cuando me decis que si son cocos son sin duda bacterias aceticas, a que género te referis? ya que por lo que tengo entendido acetobacter y gluconobacter son ambos bacilos, además no podrían ser pediococcus que son lácticas gram positivas?, esto es solo una duda teorica ya que como dije primero en este caso siempre he observado bacilos.
lo de la prueba de la catalasa suena bastante bien para confirmar si se trata de aceticas o lácticas, lo voy a poner en práctica, pero igualmente me gustaría mejorar el tema de la tinción porque no me gusta estar con dudas cuando observo al microscopio, creo que eso que me decis de la retroiluminación del microscopio es el problema que puedo estar teniendo.
Te cuento que para sacarme la duda sobre esto hice la tinción de gram sin utilizar el colorante de ácido de contraste esperando que si las bacterias estaban teñidas serían gram positivas y si estaban incoloras serían gram negativas, el tema es que las bacterias estaban de color celeste claro, definitivamente no era el color azul que corresponde a unas gram positivas pero tampoco estaban incoloras y asi otra vez me quede con dudas, hay alguna forma de mejorar este tema de la retroiluminación?
Una última consulta y como me parece que tenes experiencia en el tema voy a tratar de sacarme las dudas que tengo, es si por si acaso has usado el metodo de bioluminicencia en enología porque me gustaría saber algo sobre esto.
espero no sean demasiadas preguntas

Muchas gracias
Laura
vamonosdevinos
Super Forero
Sin conexión

#4
Mensaje enviado el: 13-10-2009, 11:50 PM

Hola Laura, lo primero disculparme por la confusión creada cuando te afirme tajantemente que si son cocos son acéticos y cuando son bacilos pueden ser acéticos o lácticos. La verdad es que las bacterias acéticas se pueden presentar de una manera polimórfica adoptando la forma de cocos, o la de bastoncillos cortos y pasando por formas ellipsoidales. En fin, que a veces se hace dificil diferenciar cocos alargados de bastoncillos cortos. Tienes toda la razón cuando dices que podrian ser pediococcus, pero tambien podrian ser leuconostoc o streptococcus, ya que todos estos géneros estan presentes en vinos y mostos y sus velos. Generalmente en estos velos donde el proceso metabólico es fundamentalmente oxidativo nos vamos a encontrar bacterias acéticas en estado polimorfo corto y sobre todo con formaciones diploides. No se si tu cultivo procede de colonias obtenidas a partir de velos de superficie o del seno general del vino, pero una vez más disculpa mi pequeña deformación explicativa por proceder de un interés enológico basado siempre en estos fenómenos de superficie del vino.

En cuanto a tu ensayo en ausencia de colorante ácido pues me resulta francamente interesante ( a mi jamás se me hubiera ocurrido ) aunque ya me cuentas que el resultado no fué el esperado.

Lo que se recomienda en estos casos ( estoy totalmente contigo cuando dices que no te gusta estar con dudas delante del micro, a mi tampoco, me pone muy nervioso ) y de verdad da muy buen resultado es rejuvenecer el cultivo y hacer la observación en plena fase exponencial. Ya verás que bien vas a discriminar los colores de gram por muy deficiente que sea tu condensador de iluminación.

Para terminar, y para lamento de ambos, pues decirte que nunca tuve la oportunidad de probar la microscopia de bioluminiscencia, siento no poder aportar nada en este sentido.

Quizás alguien del foro pueda darnos información de la técnica.

Muchos saludos Laura. Cualquier cosa cuenta, cuenta....


[Imagen: vamonosdevinos2.jpg]
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